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    ELISA實驗技巧:酶標板分類與性能判斷

    發布時間: 2023-06-05  點擊次數: 769次

    ELISA實驗技巧:酶標板分類與性能判斷

    酶標板作為ELISA檢測實驗中的輔材,起著舉足輕重的作用并直接影響最終實驗結果,酶標板的好壞主要取決于其對蛋白吸附的靈敏度、板孔間蛋白吸附能力差異以及所采購酶標板批次間的差異。因此,選擇一款蛋白吸附靈敏度高、對蛋白吸附能力孔間差異小、批次間差異小的酶標板產品,是實驗者獲得可靠、穩定實驗結果的保障。
    酶標板分類:根據不同的分類標準,酶標板有著不同的分類。

    一、根據孔數,可分為96孔、48孔等,由于酶標板主要是配合酶標儀用,目前市面上的酶標儀最多為96孔,因此酶標板最為常用的也是96孔。

    二、根據其底部的不同,又分為平底的,U型底、V型底等。平底的折射率低,適于在酶標儀檢測;U型底的酶標板折射率較高,方便加樣、吸樣、混勻等操作,可以不用放在酶標儀上,直接通過目測觀察顏色變化情況,從而判定有無相應的免疫反應。V底的酶標板可以精確的吸取樣品。

    三、根據酶標板與蛋白和其它分子結合能力的不同,又分為高結合力、中結合力和氨基化等。

    1) 高結合力
    此種酶標板,表面經處理后,其蛋白結合能力大大增強,可達300~400ng IgG/cm2,主要結合的蛋白分子量>10kD。使用該類酶標板可提高敏感性,并可相對減少包被蛋白的濃度和用量,不足之處為較易產生非特異性反應??乖蚩贵w包被后,以非離子去污劑無法有效地封閉未結合蛋白的部位,需使用蛋白作為封閉劑。

    (2) 中結合力
    此類酶標板經表面疏水鍵被動與蛋白結合,適合作為分子量>20kD的大分子蛋白的固相載體,其蛋白結合能力為200~300ng IgG/cm2。由于該類酶標板所具有的僅與大分子結合的特性,適用于作為未純化抗體或抗原的固相載體,可降低潛在的非特異性交叉反應。該類板可以惰性蛋白或非離子去污劑作為封閉液。

    (3)氨基化
    這種酶標板經表面改性處理后擁有帶正電荷的氨基,其疏水鍵由親水鍵取代。該類酶標板適合作為小分子蛋白的固相載體。使用合適的緩沖液和pH值,其表面可通過離子鍵與帶負電荷的小分子結合。由于其表面的親水特性和可通過其它交聯劑共價結合的能力,可用于固定溶于Triton-100、Tween 20等去污劑的蛋白分子。該類板的缺陷為由于降低了疏水性,一部分蛋白分子無法結合;此外,其表面需有效地封閉。由于親水和共價的表面特性,使用的封閉液必須能夠與非反應性氨基基團和所選擇的交聯劑中任何功能基團發生作用。

    四、根據顏色可分為透明、黑色、白色。
    透明的是zui常用的,用于最一般的酶聯免疫實驗。相對于透明的的酶標板,還有用于發光檢測用的不透明的酶標板,一般有黑色和白色兩種。黑色的酶標板自身會有光吸收,所以它的信號相對于白色酶標板要低很多,因此一般用于檢測較強的光,如熒光檢測。而白色的酶標板就用于較弱的光檢測,常用于一般的化學發光。另外黑色的酶標板還可以消弱非特異反應帶來的問題。同時需要注意的是,用一般的酶標板不可以進行發光檢測,因為一般從化學發光反應中發射出的光是各向同性,如果用透明的酶標板,光不僅會從垂直方向發散,還會從水平方向發散,使得光極易通過各個孔之間的間隙和孔壁,從而導致各孔的光吸收值受到相鄰孔發射光的影響。

    酶標板性能判斷

    良好的酶標板應該是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之間、同一板各孔之間性能相近。酶標板由于原料的不同和制作工藝的差別,各種產品的質量差異很大,因此,每一批號的酶標板在使用前須事先檢查其性能。

    常用的檢查方法為:以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體,保溫后洗滌,加底物顯色,終止酶反應后,分別測每孔溶液的吸光度??刂品磻獥l件,使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個讀數與全部讀數的均數之差,應小于10%。以下以A、B、C三款酶標板為例。
    直接法:檢測Human IgG在酶標板表面的吸附
    雙抗體夾心法:包被山羊抗人抗體檢測陽性血清中抗原

    由上圖可以看出,這三類酶標板中,A類酶標板具有更好的蛋白吸附效果,同時也提高蛋白吸附的靈敏度,能夠提供更為可靠的實驗數據。

    另外,可以詢問酶標板的批內差異,以下是某款酶標板的批內差異。
    由批內差異數據圖可以看出,該酶標板具有很好地批間穩定性,批內變異系數(CV)差異均在5.0%附近,明顯低于業內關于臨床免疫反應用酶標板的質量控制標準中批內變異系數低于10.0%的要求,因此也適合用于ELISA實驗。

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